鴨疫里默氏桿菌（RA）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：鴨疫里默氏桿菌（RA）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name   ：Riemerella anatipestifer Detection Kit(Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種急性或慢性傳染病，也稱新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征、鴨疫敗血癥和傳染性漿膜炎。其主要病理特征是急性或慢性敗血癥、纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎，還可以引起干酪性輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎等。發(fā)病率為 5%～90%，病死率高達(dá) 80%，給世界養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，鴨疫里氏桿菌病已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。

本試劑盒適用于檢測鴨疫里默氏桿菌病的肝臟、脾臟等臟器組織中鴨疫里默氏桿菌 DNA 的檢測，適用于鴨疫里默氏桿菌感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)鴨疫里默氏桿菌特異核酸序列設(shè)計(jì)引物和探針，用熒光 PCR 技術(shù)對(duì)鴨疫里默氏桿菌 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對(duì)可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

RA 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

RA 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃避光保存，有效期 12 個(gè)月。避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

按 NY/T 541 要求無菌采集發(fā)病鴨的肝臟或腦（有典型纖維素性滲出時(shí)采集肝臟，有神經(jīng)癥狀時(shí)采集腦）。

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

無菌取疑似鴨疫里默氏桿菌病的肝臟、脾臟等臟器組織 1.0 g～5.0 g，按 10%（g/mL）加入 PBS，研磨勻漿。

-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取， 請(qǐng)按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑RA 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請(qǐng)參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)器，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動(dòng)獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 山東省市場監(jiān)督管理局. DB37/T 3880-2020, 鴨疫里默氏桿菌病診斷技術(shù)規(guī)程[S].