手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測試劑盒

產品名稱：手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測試劑盒

英文名稱：Detection Kit for Enterovirus 71/Coxsackievirus A16/Enterovirus RNA (PCR-Fluorescence Probing)

手足口病 ( hand, foot and mouth disease,HFMD)在近年兒童中常見流行 ,由腸道病毒感染引起 ,主要表現口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹 ,主要病原為柯薩奇病毒 A16 型(CA16)和腸道病毒 71 型(EV71),二者所致的手足口病臨床難以區別。其中,EV71 不僅引起手足口病 ,而且可引起嚴重中樞神經系統并發癥 ,如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等。實現對腸道病毒的快速檢測有利于疫情監測以及制定有效的預防控制措施。本試劑盒適用于糞便、咽/拭子、肛拭子樣本中腸道病毒的檢測，并可區分是否為腸道病毒 71 型或柯薩奇病毒A16 型。檢測結果僅供研究，不用于臨床診斷。

【試劑組成】

【適用儀器】ABI 7500、LightCycler480 等多通道熒光定量PCR 儀。

【注意事項】

1.樣本處理和核酸提取（樣本處理區）

建議取 200μl 液態樣本進行核酸提取。可采用本公司生產的核酸提取/試劑盒，請按照試劑盒說明書進行操作；也可選擇其他合適的商業化產品。

本試劑盒中的陰性質控品參與提取，用于對環境進行監控；EV71/CA16/EV 陽性質控品不參與提取，用于PCR 檢測試劑的質控。2.PCR 試劑準備（試劑準備區）

從試劑盒中取出EV71/CA16/EV PCR 反應液A、EV71/CA16/EV PCR 反應液B，室溫融化后振蕩混勻，8,000rpm 離心數秒后使用。

2.1 EV71/CA16/EV 反應體系配制

取適量PCR 反應管，每管加入EV71/CA16/EV PCR 反應液A 17µl、EV71/CA16/EV PCR 反應液B 3µl（也可根據PCR 反應用量，計算各組分所需總量，混勻后分裝 20µl 于單個PCR 反應管中）；

3. 加樣（樣本制備區）

于上述PCR 反應管中分別加入處理后的陰性質控品、待測標本核酸、EV71/CA16/EV 陽性質控品各5µl，蓋緊管蓋，8,000rpm 離心數秒后轉移至擴增檢測區。

3.1  ABI Prism 7500 儀器設置（ABI 7500 儀器操作為例，ABI 7300 儀器參照此操作及儀器操作手冊）

3.1.1 打開“Setup"窗口，按樣本對應順序設置陰性質控（NTC）、陽性質控以及未知樣本（Unknown），并在“Sample Name"一欄中設置樣本名稱；探針檢測模式設置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none； Reporter

Dye3：Texas Red，Quencher Dye3：none；Passive Reference：NONE.

3.1.1  打開instrument 窗口，設置循環條件如下： 50℃ 15 分鐘，1 個循環；

95℃ 15 分鐘，1 個循環；

94℃ 15 秒→55℃ 45 秒（收集熒光），40 個循環。設置完成后，保存文件，運行程序。

3.2  LightCycler480 儀器設置

3.2.1  點擊軟件主界面的“New Experiment",進入程序設定界面。

3.2.2  檢測模式設置：從Detection Format 的下拉框中選擇分析模式：Multi Color Hydrolysis Probe,“Customizes"模塊中選擇483-533、 523-568、 558-610 濾片組合，“Block Type"為儀器自動檢測， “Plate ID"可手工輸入或掃描儀掃描，“Reaction Volume"設定為 25ul。

3.2.3  循環參數：定義PCR 程序中每個步驟（Program Name）及循環數(Cycles)和分析模式(Analysis Mode),利用“+"和“-"增加或刪除步驟，擴增參數如下：

50℃ 15 分鐘，1 個循環；

95℃ 15 分鐘，1 個循環；

94℃ 15 秒 55℃ 45 秒，40 個循環；（此步采集熒光信號：“Analysis Mode"選擇“Quantification",“Acquisition Mode"選擇 “Single"）

40℃ 10 秒，1 個循環；

3.2.4  填樣品表：點擊“Sample Editor"模塊，進入樣本信息編輯界面，在“Select Workflow"中選擇“Abs Quant",在“Sample Name" 列中定義樣本名稱,在“Sample Type"欄中選定樣品類型：陰性質控品選NTC；未知樣品選Unknown。

3.2.5  運行程序：點擊“Experiment"模塊，回到程序設定界面，點擊窗口右下方的“Start Run",彈出結果保存窗口，輸入文件名和路徑后進入程序運行界面。

4.  結果分析

4.1  反應結束后保存檢測數據文件。

4.2  分析條件設置：根據分析后圖像調節Baseline 的start 值、stop 值以及Threshold 的Value 值（用戶可根據實際情況自行調整， Start 值可以在 3～15、End 值可設在 5～20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analysis 自動獲得分析結果，在 Report界面察看結果。

【質量控制】

陰性質控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測通路無明顯擴增曲線；

陽性質控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測通路均有明顯擴增曲線，且 Ct 值≤32； 以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

【結果判斷】

1.  若檢測樣品的擴增曲線在FAM、VIC、Texas Red 檢測通路均無擴增曲線或Ct 值＞38，可判樣品為EV71、CA16、腸道病毒陰性；

2.  若檢測樣品的擴增曲線在FAM 檢測通道有擴增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為EV71 陽性；

3.  若檢測樣品的擴增曲線在VIC 檢測通道有擴增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為CA16 陽性；

4.  若檢測樣品的擴增曲線在Texas Red 檢測通道有擴增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為腸道病毒陽性，此時FAM 或VIC 通道可能為陽性，說明樣本為EV71 或CA16 陽性；FAM 及VIC 通道也可能均為陰性，說明樣本為非EV71 非CA16 的其他型別腸道病毒。

【檢測方法的局限性】

樣本檢測結果和樣本收集、處理、運送及保存質量有關，其中任何失誤都將會導致假陰性結果。如果樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現假陽性結果。

【產品性能指標】

根據產品分析性能評估結果，本試劑盒的分析靈敏度為 1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（乙型腦炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、水痘病毒、腺病毒等）無交叉反應。

【注意事項】

1. 本產品僅用于體外診斷；

2. 實驗室管理應嚴格按照PCR 基因擴增實驗室的管理規范，實驗人員必須進行專業培訓，實驗過程嚴格分區進行（試劑準備區、標本制備區、擴增和產物分析區），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；

3. 為試劑和標本準備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；

4. 試劑使用前要wan全解凍，8,000rpm 離心數秒后使用；

5. 標本制備區所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；

6. 實驗完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺和移液器,然后用紫外線燈照射 20－30 分鐘；

7. 本試劑盒內陽性質控品應視為具有傳染性物質，操作和處理均需符合相關法規要求：衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。